在林木无性繁殖中，不定根决定扦插成活率和养分吸收效率，揭示不定根发育遗传调控机制对于加速林木良种选育具有重要意义。杨树作为我国短周期工业用材林建设的主栽树种之一，在保障木材供给、推进生态防护与城乡绿化建设中均发挥着不可替代的战略作用。然而，目前杨树不定根生长发育相关的分子调控网络尚缺乏系统解析，其中的关键基因仍有待深入阐明。
近日，我所分子生物学与智慧育种研究室、林木遗传育种全国重点实验室林木基因组定向选择育种研究组在中科院一区期刊Nature communications上发表了题为“PcabHLH58/PcabHLH151 regulates adventitious root development and nitrogen uptake in poplar”的研究论文，揭示了青杨PcabHLH58和PcabHLH151介导的PcaSCL33/PcaSHR-PcaWOX5和PcaPLT1-PcaWOX5信号通路在调控根次生韧皮部细胞生长的分子机制。
研究团队基于393份青杨天然种质扦插苗不定根生根性状进行了全基因组关联分析，鉴定到两个和总根长性状密切相关PcabHLH58和PcabHLH151基因（图1）。组织特异性分析表明，PcabHLH58较PcabHLH151具有更高的表达水平，在植株的叶、不定根和侧根中表达量均较高。而PcabHLH151基因整体表达水平较低，仅在不定根和侧根存在较高的表达量。启动子活性分析结果进一步证明，上述基因均在根的韧皮部中特异性表达。
图1 全基因组关联分析鉴定到总根长性状相关的PcabHLH58和PcabHLH151基因及其启动子活性分析
为深入探究PcabHLH58和PcabHLH151的生物学功能，研究团队构建了这两个基因的过表达株系，同时利用CRISPR/Cas9技术创制了单基因编辑株系（bhlh58和bhlh151）以及双基因编辑株系（bhlh58/151）。表型分析表明，基因编辑株系的株高、地径、最大根长、总根长以及生物量均显著低于野生型（WT）。组织学分析进一步发现，基因编辑株系根的韧皮部细胞在细胞壁厚度、细胞数量和细胞大小方面均显著低于野生型（图2）。
图2 PcabHLH58和PcabHLH151过表达植株和基因编辑植株表型分析
为进一步研究韧皮部发育是否会影响植株对矿质元素的吸收利用，研究团队对上述基因的过表达和基因编辑株系扦插苗进行了低氮处理（LN）和正常氮处理（NN）。正常氮处理能够部分挽救基因编辑株系扦插苗的生长表型，而低氮处理则放大了基因编辑株系和野生型之间的表型差异。植株总氮含量和净15NO3-吸收速率方面，基因编辑株系也呈显著降低趋势（图3）。
图3 PcabHLH58和PcabHLH151过表达及基因编辑扦插苗在不同氮水平处理下表型分析
根系转录组分析表明，根系生长相关基因PagSCL33和PagPLT1a/b分别在上述基因编辑株系中和过表达植株中差异表达。酵母杂交试验、凝胶迁移试验和双荧光素酶试验证明，PcabHLH58和PcabHLH151蛋白能够通过形成同源或者异源二聚体，分别对PcaSCL33的表达起促进作用，对PcaPLT1的表达起抑制作用。其中PcabHLH58具有较高的表达水平和较强的调控能力，在该调控通路中起着主导作用（图4）。此外，PcaPAR1蛋白作为抑制因子，能够分别与PcabHLH58和PcabHLH151蛋白结合来减弱其对下游靶基因的调控作用，进而起到反馈调节的作用。
图4 PcabHLH58和PcabHLH151蛋白参与调控PcaSCL33和PcaPLT1表达分析
综上所述，该研究构建了一个杨树不定根生长发育相关的调控模型（图5），为深入解析杨树不定根生长发育的分子机理奠定理论基础，也为培育生根性状优良和氮吸收高效的杨树新品种提供宝贵的遗传资源。
图5 围绕PcabHLH58和PcabHLH151影响青杨不定根生长发育和氮吸收的调控模型
我所博士研究生魏涵天、博士后周星鲁为该论文的共同第一作者，张磊助理研究员、胡建军研究员为该论文的通讯作者。研究工作得到了中国林科院基本科研业务费（CAFYBB2024QF011）、国家自然科学基金项目（32401601和32071797）以及农业生物育种科技重大专项（2023ZD04072和2022ZD0401501）等项目的支持。
（文：张磊、魏涵天/林业所 图：魏涵天、周星鲁/林业所）